Anko Mitarashi dient als Tokubetsu Jōnin von Konohagakure und beaufsichtigte zunächst die Chūnin-Prüfungen, bevor sie an der Konoha-Akademie unterrichtete. Ihr Genin-Team wurde von Orochimaru angeführt, das Hayate Gekkō, Ibiki Morino und Tokara während ihrer eigenen Chūnin-Prüfungen gegenüberstand. Orochimaru vermittelte ihr charakteristische Jutsu und Konzepte der Unsterblichkeit und wählte sie als einzige Überlebende seines Experiments mit dem Himmelssiegel an zehn Probanden aus. Nach Erhalt des Siegels lehnte sie seinen Weg ab. Orochimaru manipulierte ihre Erinnerungen, sodass sie glaubte, sie sei wegen mangelnden Antriebs verlassen worden, anstatt ihre Entscheidung zur Rebellion, was ihren anhaltenden Groll und ihr Pflichtgefühl festigte, seine Pläne zu vereiteln.

Impulsiv, laut und stur – Eigenschaften, die mit Naruto Uzumaki verglichen werden – zeigt Anko spielerische Intensität, wie etwa das Werfen eines Kunai auf Naruto und das Lecken seines Blutes, wenn sie verspottet wird. Dennoch zeigt sie erbitterte Loyalität zu Konoha, stellt sich oft allein Bedrohungen entgegen, um andere zu schützen, besonders in Bezug auf Orochimaru. Obwohl sie ihn einst nachahmen wollte, beschloss sie, seine Lehren gegen ihn einzusetzen. Der Dritte Hokage riet ihr, sich nicht für Orochimarus Taten selbst die Schuld zu geben.

Optisch hat Anko hellbraune, pupillenlose Augen und kurzes, stacheliges violett schimmerndes Haar. Ihre Standardkleidung umfasst einen maßgeschneiderten Metallnetzanzug unter einem beigen Übermantel mit violetten Nähten, einen dunkelorangen Minirock, einen dunkelblauen Gürtel, hellgraue Schienbeinschützer und ein Schlangenzahn-Amulett neben ihrem Kopfschutz. In ihrer Kindheit trug sie ärmellose Kettenpanzer, Armbänder, dunkle Shorts und knielange Stiefel. Jahre nach dem Vierten Shinobi-Weltkrieg nahm sie eine kräftigere Statur an, eine orangefarbene Bluse mit einem weißen Umhangcape und roten Lippenstift.

Ihre Fähigkeiten spiegeln ihren Status als Elite-Kunoichi wider. Frühzeitiges Talent zog Orochimarus Unterricht in Jutsu wie Versteckte Schlangenhände und Mehrfach zuschlagende Schattenschlangen an, die sie meisterte, um das Ino-Shika-Chō-Trio auszumanövrieren. Sie lernte auch die verbotene Selbstmordtechnik des Gegenseitigen Schlangentods. Als erste Überlebende des Fluchtsiegels widerstand sie dessen periodischen Ausbrüchen, bis es nach dem Krieg entfernt wurde. Zu ihren Fertigkeiten gehören punktgenaue Treffsicherheit, Giftimmunität, Feuer-Release-Flammenströme und Yin-Release-sensorische Illusionen. Ihre Spurensucherexpertise führte zu Missionen gegen Kabuto Yakushi.

Während der Chūnin-Prüfungen beaufsichtigte Anko den Wald des Todes. Bei der Entdeckung von Orochimarus Infiltration durch getötete Kusa-Nin konfrontierte sie ihn allein; er bewegungsunfähigte sie, indem er ihr Fluchtsiegel reaktivierte, und offenbarte sein Interesse an Sasuke Uchiha. Sie riet dem Dritten Hokage, Sasuke von den Prüfungen auszuschließen, wurde aber überstimmt. Während des Konoha-Überfalls half sie bei der Evakuierung von Zivilisten und nahm an der Beerdigung des Dritten teil.

Anime-Erweiterungen zeigen ihre Mission ins Land des Meeres – wo sie das Fluchtsiegel erhielt – und die Wiedererlangung unterdrückter Erinnerungen, die ihre freiwillige Ablehnung Orochimarus bestätigten. Im Vierten Shinobi-Weltkrieg führte sie Aufklärungseinheiten bei der Jagd auf Kabuto an. Nach der Schlussfolgerung, dass er Orochimarus Kräfte kontrollierte, verfolgte sie ihn allein, wurde aber gefangen genommen. Kabuto hielt sie bewusstlos, um das Chakra ihres Fluchtsiegels abzuzapfen und seine Wiederbelebungs-Jutsu zu verstärken. Nach ihrer Rettung durch Jūgo extrahierte Sasuke Uchiha Orochimarus Überreste mittels der Methode der bösen Befreiung, wodurch das Siegel dauerhaft gelöscht wurde.

Nach dem Krieg unterrichtete Anko an der Konoha-Akademie. Ein Jahrzehnt später stand sie als legendäre Kunoichi da, deren Vermächtnis von einem Weg von Trauma und Konflikt hin zu Versöhnung und Mentorschaft geprägt ist.