Im Anime-Film Batman Ninja vs. Yakuza League ist Harley Quinn eine wiederkehrende Figur aus dem vorherigen Teil Batman Ninja. Ihr visuelles Design in dieser Fortsetzung erfährt eine deutliche Abkehr von ihrer früheren, von Samurai inspirierten Ästhetik hin zu einer, die von modernen japanischen Jugend-Subkulturen beeinflusst ist. Sie wird mit einem langen Rock dargestellt und nimmt die Haltung ein, die mit Yankee- oder Sukeban-Stilen verbunden ist, die oft mit japanischen Delinquenten und Bikern assoziiert werden. Ihr Look enthält auch Elemente, die an eine Trickster-Figur erinnern, wobei eine Beschreibung ihr Aussehen mit dem eines wilden Narren vergleicht.

Als Charakter wird Harley Quinn als hochgradig aggressiv und freiheitsliebend dargestellt und agiert als primäre Partnerin und Begleiterin des Jokers. Ihre Persönlichkeit neigt zu chaotischem und ungezügeltem Verhalten, und die Darstellung der Rolle wird als mit völliger Freiheit ausgeführt beschrieben, was ihre unberechenbare Natur betont. Sie wird im Film unter dem Alias Harin, der wilde Narr, identifiziert.

Ein zentraler Aspekt von Harleys Rolle in der Handlung ist ihre Beziehung zu einer alternativen Version von Wonder Woman namens Daiana, der Adlergöttin, die die Amazonen-Familie anführt. Innerhalb der Geschichte dient Daiana als Beschützerin für Harley, und es wird angemerkt, dass Harley eine romantische Schwärmerei für Daiana entwickelt hat. Diese Dynamik wird zu einem wichtigen Teil ihres Charakterbogens in der veränderten Welt des Films. Ihre Geschichte soll der von Dick Grayson, dem ersten Robin, ähneln, wobei ihre Darstellung an die berühmte Einführung von Robin erinnert, aber mit Daiana in der Rolle von Batman und Harley in der Rolle des jungen Lehrlings.

Was ihren Hintergrund und ihre Motivationen betrifft, ist Harley ein einzigartiger Fall in der Handlung des Films. Sie ist keine Version aus einem alternativen Universum, sondern dieselbe Harley Quinn aus Batmans ursprünglicher Zeitlinie. Sie ist keine Einheimische der von der Yakuza beherrschten Welt von Hinomoto, sondern reiste dorthin und beschloss, einfach aus Spaß eine Yakuza zu werden. An einem Punkt der Geschichte flieht sie zusammen mit dem Joker aus dem Gefängnis.

In Bezug auf ihre Fähigkeiten wird sie als fähige Kämpferin gezeigt, die ihre charakteristische Waffe, einen großen Schläger mit eingeschlagenen Nägeln, schwingt, was zum aggressiven und brutalen Ton ihres Charakterdesigns passt. Das Kreativteam des Films hat sie als einen der aggressivsten Charaktere hervorgehoben, was auf eine Fertigkeit im physischen, schlagkräftigen Kampf hindeutet.