Kyūbei Yagyū, Erbin des Namens der Yagyū-Familie, wuchs unter der männlich geprägten Tradition des Clans auf, nachdem ihre Mutter nach der Geburt verstorben war. Sie wurde von ihrem Vater Yagyū Koshinori und ihrem Großvater Yagyū Binbokusai aufgezogen und erlebte in ihrer Kindheit Mobbing durch Gleichaltrige, die sie als unzulänglichen Jungen betrachteten. In dieser Zeit knüpfte sie eine entscheidende Bindung zu Shimura Tae, die sie vor ihren Peinigern beschützte. Kyūbei bewunderte zutiefst Taes Verbindung von Stärke und Weiblichkeit und strebte danach, ihr nachzueifern. Ein prägendes Ereignis in ihrer Kindheit war, als Kyūbei eingriff, als Schuldeneintreiber Tae und ihren Bruder Shinpachi angriffen. Der Schutz der beiden kostete Kyūbei ihr linkes Auge. Von Schuldgefühlen geplagt, schwor Tae, Kyūbeis "neues linkes Auge" zu werden. Dieses Ereignis entfachte Kyūbeis Entschlossenheit, konventionelle Stärkemaßstäbe zu übertreffen – mit dem Ziel, jeden Mann oder jede Frau, sogar Tae selbst, zu überragen. Sie begab sich jahrelang hartem Training, kehrte Jahre später zurück und beabsichtigte, Tae zu heiraten. Obwohl ihr Heiratsantrag scheiterte, nachdem sie in einem Dojo-Kampf gegen Shinpachi und seine Verbündeten verlor, bewahrte Kyūbei tiefe Gefühle für Tae. In späteren Handlungsbögen blieb sie leidenschaftlich beschützend, rettete Tae während des Silver-Soul-Arcs vor der Hinrichtung und erklärte sich bereit, an ihrer Seite zu sterben. Anfangs wirkte Kyūbei kalt und zurückhaltend und trug typischerweise maskuline Kleidung: einen weißen Mantel mit rotem Besatz über einem blauen Kimono, eine schwarze Augenklappe und einen Pferdeschwanz. Ihre Erziehung führte zu einem reflexiven Unbehagen bei körperlichem Kontakt mit Männern, weshalb sie jeden Mann, der sie berührte, wegwarf – eine Manifestation von Androphobie. Ausnahmen bildeten Sakata Gintoki, dessen Berührungen bei ihr gelegentlich verwirrte oder errötende Reaktionen auslösten. Dies veranlasste ihren Gefolgsmann Tōjō Ayumu, strategisch ihre Interaktionen zu fördern, um "ihre Jungenhaftigkeit zu beenden". Kyūbeis Persönlichkeit wurde nach dem Yagyū-Arc deutlich weicher und zeigte gelegentlich feminine Nuancen. Während des Dekoboko-Arcs kämpfte sie mit Verwirrung über ihre Geschlechtsidentität, die aus ihrer männlich geprägten Erziehung resultierte, lehnte jedoch binäre Definitionen letztlich ab und entschied sich, ausschließlich als "Yagyū Kyūbei" zu leben. Bei femininer Präsentation trug sie zwei Zöpfe, eine mit Blumen verzierte Augenklappe, einen pinken Kimono und Oberschenkelstrümpfe. Als Meisterin des Yagyū-Ryū-Schwertkampfstils nach intensivem Training führte Kyūbei blitzschnelle Angriffe aus. Sie galt als eine der stärksten Kämpferinnen des Clans und übertraf Elitekämpfer wie Hijikata Tōshirō (wobei sie seine teilweise Zurückhaltung anerkannte). Selbstüberschätzung führte zu ihrer Niederlage gegen Gintoki, der ihre taktische Unerfahrenheit ausnutzte. Ihre Beziehungen umfassen den loyalen Dienst von Ayumu (der ihr häufig Gothic-Lolita-Mode aufzwang, trotz ihres Unbehagens) und eine Rivalität mit Kondō Isao um Taes Aufmerksamkeit. Mit Tsukuyo teilte sie kooperative Momente im Kampf, in denen beide über die Akzeptanz ihrer Weiblichkeit reflektierten. Ihr Haustier, Jugem Jugem, entwickelte eine tiefe Bindung zu ihr. Gintoki gewann ihren Respekt nach ihrem Konflikt und war der Einzige, der bei ihr komische oder nervöse Reaktionen hervorrief, wobei die Handlung Andeutungen auf mögliche romantische Spannung während Gruppenterminen oder durch Amnesie ausgelöste emotionale Momente machte.