A Certain Scientific Railgun spielt in Academy City, einer weitläufigen, futuristischen Metropole, die ein Drittel des westlichen Tokios bedeckt. Diese Stadt beherbergt 2,3 Millionen Einwohner, von denen die überwiegende Mehrheit Schüler sind, die das spezielle Curriculum der Stadt durchlaufen haben, um psychische Kräfte, sogenannte Esper-Fähigkeiten, zu entwickeln. Diese Fähigkeiten werden von Level 0, für diejenigen ohne messbare Kraft, bis zum nahezu gottgleichen Level 5 eingestuft, von dem es in der gesamten Stadt nur sieben gibt.

Die Geschichte konzentriert sich auf eine dieser sieben, Misaka Mikoto, die drittplatzierte Level 5, bekannt als die Railgun. Als Schülerin der renommierten Mädchenschule Tokiwadai Middle School ist Misaka eine Elektromasterin mit unglaublicher Kraft, die in der Lage ist, Elektrizität zu erzeugen und zu manipulieren, um verheerende Angriffe zu erschaffen, wie das Abfeuern einer Metallmünze mit der dreifachen Schallgeschwindigkeit. Trotz ihrer immensen Kraft ist sie ein freundliches, energiegeladenes und äußerst unabhängiges Mädchen mit einem starken Gerechtigkeitssinn. Sie teilt sich ein Zimmer mit ihrer jüngeren Mitschülerin, Shirai Kuroko, einer Level-4-Teleporterin, die auch Mitglied von Judgment ist, einer von Schülern geführten öffentlichen Sicherheitsorganisation, die die Ordnung in der Stadt aufrechterhält. Kuroko ist Misaka, die sie Schwester nennt, intensiv ergeben, oft zum Verdruss der Letzteren.

Kurokos Partnerin in Judgment ist Uiharu Kazari, ein sanftes und fröhliches Mädchen mit einem Talent für Computer-Hacking, das die weniger renommierte Sakugawa Middle School besucht. Ihre beste Freundin und Klassenkameradin ist Saten Ruiko, ein aufgewecktes und neugieriges Mädchen, das ein Level 0 ist, was bedeutet, dass sie keine erkennbare Esper-Kraft besitzt. Infolgedessen ist Saten fasziniert von den in der Stadt kursierenden urbanen Legenden und hofft oft, eine Abkürzung zum Erlangen von Fähigkeiten zu finden. Gemeinsam meistern diese vier Freundinnen die Herausforderungen des Schullebens, während sie sich in die dunkleren Geheimnisse verstricken, die unter der glänzenden, hochtechnologischen Oberfläche von Academy City lauern.

Der erste große Handlungsbogen dreht sich um eine urbane Legende namens Level Upper, eine mysteriöse Audiodatei, von der es heißt, dass sie die Esper-Fähigkeit einer Person künstlich verstärkt. Als zahlreiche Schüler, die den Level Upper verwendet haben, in unerklärliche Komas fallen, untersuchen Misaka und ihre Freundinnen dies und entdecken, dass die Datei die Gehirnwellen ihrer Nutzer zu einem einzigen massiven Netzwerk verbindet. Ihre Untersuchung führt sie zu Kiyama Harumi, einer brillanten und verzweifelten Forscherin, die den Level Upper geschaffen hat, um genügend Rechenleistung zu sammeln, um eine Gruppe ihrer ehemaligen Schüler zu retten, Kinder, die als ahnungslose Testpersonen in einem grausamen Experiment verwendet wurden und seitdem im Koma liegen.

Danach adaptiert die Serie den Sisters-Bogen, der ursprünglich eine zentrale Handlung in der Mutterserie A Certain Magical Index war. Die Erzählung enthüllt, dass Misakas eigene DNA gestohlen wurde, als sie ein Kind war, und verwendet wurde, um über zwanzigtausend militärische Klone, bekannt als die Sisters, zu erschaffen. Diese Klone werden als Wegwerfziele für den mächtigsten und gewalttätigsten Level 5 der Stadt, Accelerator, in einem Projekt verwendet, das ihm ermöglichen soll, sich zu einem Level 6 zu entwickeln. Entsetzt und von Schuldgefühlen geplagt, kämpft Misaka verzweifelt darum, das Abschlachten ihrer Klone zu stoppen, nur um zu erkennen, dass ihre Kräfte gegen den scheinbar unbesiegbaren Accelerator nutzlos sind. An ihrem Tiefpunkt erhält sie unerwartete Hilfe von einem scheinbar machtlosen Jungen namens Kamijou Touma, dessen rechte Hand die mysteriöse Fähigkeit besitzt, jede übernatürliche Kraft zu negieren.

Die letzte Staffel führt den Daihaseisai ein, ein riesiges stadtweites Sportfest, bei dem Misaka Ziel einer finsteren Verschwörung wird, die einen Wissenschaftler aus ihrer Vergangenheit betrifft. Sie wird in eine instabile und erzwungene Evolution in Richtung eines Level-6-Zustands gezwungen, die die Stadt zu zerstören droht. Um sie zu retten, muss sie sich auf die Hilfe unerwarteter Verbündeter verlassen, einschließlich der mysteriösen Level-5-Mentalmanipulatorin Shokuhou Misaki, die ihre eigene verborgene Geschichte mit Misaka hat. Die Serie erforscht weiterhin die Bindung zwischen den vier Freundinnen, den wahren Preis des wissenschaftlichen Fortschritts und die unsichtbare Dunkelheit, die direkt unter der Oberfläche ihrer scheinbar idealen Stadt existiert.