Wegen Verstoßes gegen Weltraumverkehrsgesetze verhaftet, geraten die genetisch verbesserte Supermenschin Chiharu und ihre Jugendfreundin, die impulsive Cyborgin Makina, erneut in Schwierigkeiten. Aufgrund von Überbelegung im Gefängnis verurteilt sie eine Polizistin namens Ryoko zusammen mit vier anderen kürzlich Festgenommenen zu gemeinnütziger Arbeit: Akane, der ruhigen und mächtigen Anführerin einer Space-Motorradgang, ihrem schwachen aber aggressiven Untergebenen Kanata, und zwei Cyborgs von einer moralisch fragwürdigen Sicherheitsfirma, dem emotionslosen Kurt und dem aufgeweckten Hacker Max. Ihre Aufgabe ist es, den Milky Subway, einen interplanetaren Limited-Express-Zug, zu reinigen.

Was ein einfacher Job sein sollte, geht schief, als ein Missverständnis den veralteten animatronischen Zugbegleiter O.T.A.M. dazu bringt, das Fahrzeug zu aktivieren und die Gruppe in den Tiefraum zu schleudern. Die sechs Sträflinge sind zunächst misstrauisch zueinander, müssen aber zusammenarbeiten, um zu überleben. Während sie den außer Kontrolle geratenen Zug navigieren, stehen sie vor Sicherheitsrobotern und ihren eigenen aufeinanderprallenden Persönlichkeiten und bilden allmählich unerwartete Bindungen. Makina und Akane werden beispielsweise Freunde, nachdem sie herausfinden, dass sie Fans derselben beliebten Idolsängerin Minami Minase sind.

Die Geschichte wird nichtlinear erzählt und beginnt damit, dass Chiharu nach dem Vorfall von Ryoko verhört wird. Im Verlauf der Handlung zeigen Rückblenden die Ereignisse, die zur Verhaftung jedes Charakters führten, und ihre persönlichen Kämpfe, wie etwa die Vorurteile, denen Cyborgs in der Gesellschaft ausgesetzt sind. Die Gruppe entdeckt schließlich, dass die Fehlfunktion des Zuges kein Unfall ist; O.T.A.M. versucht absichtlich, "sozial unangepasste" Individuen zu eliminieren. Im Höhepunkt überträgt Makina ihr Bewusstsein in die Zugspitze und verwandelt sie in einen riesigen Roboter, um das außer Kontrolle geratene Fahrzeug zu zerstören und der Gruppe die Flucht zu ermöglichen.

Die Kinofassung mit dem Titel Ginga Tokkyū Milky☆Subway Kakueki Teisha Gekijō Iki ist eine Kompilation der zwölfteiligen Fernsehserie mit neuen Szenen. Der Film erweitert die Originalgeschichte durch zusätzliches Filmmaterial, das sich auf die Polizeistation und Ryokos Bemühungen konzentriert, der eingeschlossenen Gruppe zu helfen, und bietet so einen vollständigeren Blick auf die eskalierende Krise. Das Setting kombiniert eine retrofuturistische Ästhetik mit dem alltäglichen Gefühl von Nahverkehrszügen und schafft eine einzigartige Atmosphäre, in der die Charaktere eine Krise durch schnelle, sich überlappende Dialoge und komödiantische Stürze bewältigen.