Fünfzehn Jahre nach einem katastrophalen globalen Ereignis, bekannt als der Second Impact, das den Planeten verwüstete und die Erdachse verschob, befindet sich die Welt immer noch in einem fragilen Zustand der Erholung. Die neueste Bedrohung für die Menschheit kommt in Form der Engel, kolossale, monströse Wesen unbekannter Herkunft, die mit erschreckender Regelmäßigkeit über der stark befestigten Stadt Tokyo-3 erscheinen. Konventionelle Militärstreitkräfte sind gegen ihre undurchdringlichen Kraftfelder, bekannt als Absolute Terror (AT) Fields, machtlos. Die letzte Hoffnung der Menschheit ruht auf der paramilitärischen Organisation NERV und ihrer ultimativen Waffe: den Evangelions. Dies sind riesige, biomechanische Humanoiden, die einzigen Waffen, die den Engeln ebenbürtig sind.

Allerdings ist das Steuern eines Evangelion mit einer einzigartigen und schrecklichen Bedingung verbunden. Die neuronale Verbindung, die zur Kontrolle der riesigen Maschine erforderlich ist, erzeugt eine starke psychologische Rückkopplungsschleife, was sie nur für einige wenige Kinder möglich macht, die kurz nach dem Second Impact geboren wurden. Die Handlung konzentriert sich auf Shinji Ikari, einen tief introvertierten und emotional zurückgezogenen vierzehnjährigen Jungen, der von seinem entfremdeten und kalt manipulativen Vater, Gendo Ikari, dem Oberbefehlshaber von NERV, nach Tokyo-3 gerufen wird. Von seinem Vater jahrelang im Stich gelassen und vom Verlust seiner Mutter verfolgt, wird Shinji in das Cockpit des Evangelion Unit-01 gezwungen und angewiesen, die Stadt gegen den ersten Engelangriff zu verteidigen. Von Ablehnung geängstigt, aber verzweifelt nach irgendeiner Form der Anerkennung, stimmt er widerwillig zu und beginnt seine qualvolle Reise als das Third Child.

Shinji trägt seine Last nicht allein. Er lebt mit Misato Katsuragi, einer brillanten und freiheitsliebenden NERV-Operationsdirektorin, die als seine Vormundin fungiert und eine Fassade von lässiger Fröhlichkeit nutzt, um ihr eigenes tiefsitzendes Trauma vom Second Impact zu verbergen. Im Kampf sind seine Mitpiloten das First Child, Rei Ayanami, ein mysteriöses, scheinbar emotionsloses Mädchen, das Gendo völlig ergeben ist und dessen wahre Natur eines der dunkelsten Geheimnisse der Organisation ist, und das Second Child, Asuka Langley Soryu, eine feurige und überaus talentierte Pilotin aus Deutschland, die ihre tiefe Unsicherheit und Kindheitsverlassenheit hinter einer Maske arroganten Stolzes verbirgt.

Im Verlauf der Serie werden die Engelangriffe immer verzweifelter und psychisch verheerender. Die Handlungsbögen gehen über eine einfache Monster-der-Woche-Struktur hinaus und werden zu einer tiefgründigen Charakterstudie gebrochener Individuen. Shinji kämpft mit Selbstwertgefühl und der Angst vor menschlicher Verbindung, in dem Glauben, andere zu kennen bedeute, von ihnen verletzt zu werden. Asukas Ego zerbricht, als ihre Synchronisationsrate sinkt und sie von einem Engel besiegt wird, was zu einem vollständigen psychischen Zusammenbruch führt. Rei beginnt, ihre eigene Identität und programmierte Loyalität in Frage zu stellen, als sie zerbrechliche, beispiellose Bindungen zu Shinji entwickelt. Die Action verschärft sich, als NERV einen neuen Piloten einführt, Toji Suzuhara, einen Klassenkameraden von Shinji, mit katastrophalen Folgen, und später, als das engelhafte Wesen Kaworu Nagisa die Organisation infiltriert und eine tiefe, tragische Bindung zu Shinji aufbaut, bevor er seinen wahren, schrecklichen Zweck offenbart.

Unter der Oberfläche des Krieges brodelt eine Verschwörung. Es stellt sich heraus, dass NERV mehr als nur eine Verteidigungstruppe ist. Commander Ikari verfolgt heimlich das Human Instrumentality Project, einen Plan, die Menschheit gewaltsam weiterzuentwickeln, indem die psychologischen Barrieren zwischen Individuen – die metaphysischen AT Fields – aufgebrochen und alle menschlichen Seelen zu einer einzigen, gottgleichen Entität verschmolzen werden. Dieses Vorhaben, orchestriert von der Geheimgesellschaft SEELE, beinhaltet die Manipulation der Engel, der Evangelions (die sich als geklonte Riesen des ersten Engels, Adam, entpuppen) und des Wesens namens Lilith, das in den Tiefen des NERV-Hauptquartiers gekreuzigt ist. Der letzte Handlungsbogen zeigt, wie SEELE sich gegen NERV wendet und eine groß angelegte militärische Invasion startet, um die Kontrolle über die Instrumentality zu übernehmen. Shinji, Asuka und Rei werden im Zentrum des apokalyptischen Third Impact gefangen, was zu einem surrealen, introspektiven Finale führt, in dem Shinji gezwungen ist, sich seinen tiefsten Ängsten, der Natur seiner Realität und der ultimativen Wahl zwischen dem Schmerz der Individualität und dem Frieden der Vergessenheit zu stellen.