Graf Cagliostro, dessen richtiger Name Giuseppe Balsamo ist, tritt in Le Chevalier D'Eon als Gelegenheitshändler und Alchemist auf, der für den mysteriösen Comte de Saint-Germain arbeitet. Er wird als eher distanzierter und ausschweifender Mann eingeführt, der zunächst in Russland Parfüm verkauft und auf seinen Reisen eine bemerkenswerte Vorliebe für edle Spirituosen entwickelt hat. Er beschreibt sein eigenes Leben als eine Komödie auf der Bühne und äußert den Wunsch, stattdessen eine Tragödie von hohem Rang zu schaffen.

In der Geschichte fungiert Cagliostro als schurkischer Gegenspieler, der sich mit Maximilien Robespierre und seiner eigenen Geliebten Lorenza verschwört, um den Protagonisten D'Eon de Beaumont in eine Falle zu locken. Sein Hauptmotiv ist es, das Geheimnis der Königlichen Psalmen zu lüften, eines übernatürlichen Elements, das für die Handlung zentral ist. Um dies zu erreichen, versucht er, die Seele zu stehlen, die von dem französischen Ritter Besitz ergriffen hat, mit der Absicht, Lorenza als deren Gefäß zu nutzen. Im Gegensatz zu anderen Figuren, die die Macht der Psalmen direkt einsetzen, verwendet Cagliostro sie selbst nicht; stattdessen erkennt er ihre immense Macht und manipuliert Lorenza, die eine Anwenderin ist und keine Angst vor dem Töten hat, als sein Werkzeug.

Im Verlauf der Serie wechseln Cagliostros Allianzen. Anfangs ein Verbündeter von Saint-Germain, verrät er ihn später, um für Maximilien Robespierre zu arbeiten. Seine Rolle bringt ihn in Opposition zu D'Eon und seinen Gefährten, den Vier Musketieren. Am Ende des Animes, nachdem Robin den Namen Maximilien annimmt, um eine Revolution anzuführen, wird Cagliostro hinter ihm stehend gezeigt, was auf seine fortwährende Präsenz und seinen Einfluss hindeutet.