"Samurai Girls" spielt in einer alternativen Version Japans, in der die Geschichte des Landes durch eine mysteriöse Macht namens "Master Samurai" geprägt wurde. Diese Macht ermöglicht es bestimmten Mädchen, sich in mächtige Kriegerinnen, sogenannte "Samurai Girls", zu verwandeln. Die Handlung konzentriert sich auf Jūbei Yagyū, einen jungen Samurai, der in die Tokugawa-Akademie eintritt, eine Schule, die von den Nachkommen berühmter Samurai-Familien besucht wird. Jūbei ist ein Meister des Schwertkampfes, doch seine Fähigkeiten werden auf die Probe gestellt, als er auf eine Reihe von Mädchen trifft, die über die Fähigkeit verfügen, sich in Samurai-Kriegerinnen zu verwandeln.

Die erste dieser Kriegerinnen ist Muneakira Yagyū, eine mysteriöse und starke Samurai, die Jūbei beschützt und ihm hilft, seine Mission zu erfüllen. Im Laufe der Serie trifft Jūbei auf weitere Samurai Girls, darunter Sen Tokugawa, die Enkelin des Shoguns, und Gisen Yagyū, eine weitere Kriegerin mit einer engen Verbindung zu Jūbeis Vergangenheit. Jede dieser Mädchen besitzt einzigartige Fähigkeiten und eine tiefe Verbindung zur Geschichte Japans, die durch die Master Samurai-Macht beeinflusst wurde.

Die Handlung entwickelt sich um den Konflikt zwischen den Samurai Girls und einer geheimnisvollen Organisation, die die Macht der Master Samurai für ihre eigenen Zwecke nutzen will. Jūbei und seine Verbündeten müssen sich gegen diese Bedrohung stellen, während sie gleichzeitig die Geheimnisse ihrer eigenen Vergangenheit und die wahren Absichten der Master Samurai aufdecken. Die Serie verbindet Action, historische Elemente und übernatürliche Kräfte, wobei die Beziehungen zwischen den Charakteren und ihre individuellen Entwicklungen im Mittelpunkt stehen.

Die Tokugawa-Akademie dient als zentraler Schauplatz, an dem die Charaktere zusammenkommen und ihre Fähigkeiten trainieren, während sie sich auf den bevorstehenden Kampf vorbereiten. Die Serie erkundet Themen wie Loyalität, Ehre und die Bedeutung der Vergangenheit, während die Charaktere mit ihren eigenen inneren Konflikten und den Herausforderungen ihrer Mission konfrontiert werden.