In einer alternativen Realität, in der außerirdische Invasoren namens Amanto das feudale Japan erobert haben, sind Schwerter verboten und Samurai haben ihren Platz in der Gesellschaft verloren. Gintoki Sakata, ein wildhaariger Silbersamurai mit einer Schwäche für Süßes und keiner Lust, Regeln zu befolgen, betreibt ein freiberufliches Gelegenheitsjob-Unternehmen namens Yorozuya. Ihm zur Seite stehen Shinpachi Shimura, ein gutmütiger Junge mit Brille, der oft als ernster Gegenpart dient, und Kagura, ein überstarkes Teenager-Mädchen vom außerirdischen Yato-Clan mit einem unersättlichen Appetit. Zusammen mit ihrem riesigen Hund Sadaharu nehmen sie jeden Job an, um die Miete zu bezahlen, die irgendwie nie bezahlt wird.

Die vierte Staffel, die von April 2009 bis März 2010 51 Episoden ausstrahlte, setzt die charakteristische Mischung aus chaotischer Komödie, Popkultur-Parodien und plötzlichen Wechseln zu gefühlvollen Actionszenen fort. Die Yorozuya geraten in absurde Situationen, wie versehentlich die Frisur des Shogun beim Friseur zu ruinieren, an einem hochriskanten Rennen teilzunehmen, um der offizielle Fanclub der Pop-Idol Terakado Tsu zu werden, und sich mit einem mayonnaisebesessenen Polizisten namens Toshiro Hijikata auseinanderzusetzen, der an Gintoki gefesselt wird.

Mehrere größere Handlungsbögen entfalten sich in dieser Staffel. Im Red-Spider-Bogen stellen sich Gintoki und Tsukuyo, die Hüterin des gesetzlosen Vergnügungsviertels Yoshiwara, einem legendären Attentäter namens Jiraia. Jiraia ist Tsukuyos ehemaliger Meister, der sie in den brutalen Künsten der Schattenkrieger ausbildete, doch seine verdrehte Hingabe droht nun, sie und die Stadt zu zerstören. Der Bogen taucht ein in Gintokis Vergangenheit und seine eigene Beziehung zu seinem Mentor und enthüllt schmerzhafte Erinnerungen, die ihn geprägt haben.

Die Staffel enthält auch den Popularity-Poll-Bogen, in dem die Charaktere auf typisch meta und selbstzerstörerische Weise auf die Ergebnisse einer offiziellen Fan-Rangliste reagieren. Der Otsu-chan-Bogen zeigt, wie Hijikata und Shinpachi in einem bizarren Sammelkarten-Kampfturnier antreten, um über das Schicksal der Fanclubs ihrer Lieblings-Idole zu entscheiden, während ein Computervirus die Roboter-Maid Tama infiziert und die Yorozuya zwingt, in ihre digitale Welt einzudringen, um die Infektion zu bekämpfen.

Spätere Episoden führen den Onmyoji-Bogen ein, in dem sich herausstellt, dass die Wetteransagerin Ketsuno Ana aus einer Familie traditioneller Geisterbeschwörer stammt und ihre genauen Vorhersagen von rivalisierenden Zauberern sabotiert werden. Die Staffel endet mit einem weihnachtlich thematisierten Wettbewerb, bei dem mehrere als Weihnachtsmänner verkleidete Charaktere darum kämpfen, zu beweisen, wer der echte ist, und schließt mit einer überraschend herzlichen Note, als Kagura allen frohe Weihnachten wünscht.

Während der gesamten Staffel ist die Polizeitruppe Shinsengumi ständig präsent, wobei Kommandant Kondo Isao, der sadistische Sougo Okita und der mayonnaise-liebende Hijikata oft mit den Yorozuya aneinandergeraten oder widerwillig mit ihnen zusammenarbeiten. Der zum Flüchtling gewordene Terrorist Kotaro Katsura und sein mysteriöser tierähnlicher Begleiter Elizabeth tauchen ebenfalls häufig auf und tragen zum Chaos bei. Zwei Opening-Themen werden verwendet: Stairway Generation von Base Ball Bear für die erste Hälfte und Light Infection von Prague für die zweite Hälfte, zusammen mit vier Ending-Themen. Die Staffel balanciert episodische komödiantische Abenteuer mit längeren, dramatischeren Bögen, die die Vergangenheit der Charaktere und die wachsenden Bedrohungen für Edo erkunden und so die Bühne für die zunehmend ernsteren Konflikte bereiten, die noch kommen werden.