In einer alternativen Version der Edo-Zeit Japans füllten plötzlich außerirdische Raumschiffe den Himmel. Diese Außerirdischen, bekannt als die Amanto, fielen auf der Erde ein und übernahmen schnell die Kontrolle über die Regierung. Das Shogunat wurde zu einer Marionettenregierung herabgestuft, und ein neues Gesetz wurde erlassen, das das Tragen von Schwertern in der Öffentlichkeit verbot, wodurch die Ära der Samurai effektiv beendet wurde. Die Geschichte spielt etwa zwanzig Jahre nach dieser Invasion, in der die Stadt Edo zu einem chaotischen Mix aus traditioneller japanischer Architektur, futuristischer Technologie der Aliens und bizarren außerirdischen Wesen geworden ist, die Seite an Seite mit Menschen leben.

Im Mittelpunkt der Serie steht Gintoki Sakata, ein fauler, exzentrischer und chronisch pleiter Silberhaar-Samurai, der immer noch ein Holzschwert trägt und hartnäckig an seinem Kriegergeist festhält. Er betreibt ein kleines Geschäft namens Yorozuya, was mit „Gelegenheitsarbeiten“ oder „wir können alles machen“ übersetzt werden kann, aus einer heruntergekommenen Wohnung im zweiten Stock. Seine beiden Hauptangestellten sind Shinpachi Shimura, ein gutmütiger Teenager mit Brille, der oft als ernste Gegenfigur zu Gintokis Eskapaden fungiert und versucht, die Ehre des Dojos seiner Familie aufrechtzuerhalten, und Kagura, ein scheinbar süßes junges Mädchen, das tatsächlich ein Mitglied des körperlich starken Yato-Außerirdischenclans ist und übermenschliche Kräfte sowie einen unersättlichen Appetit besitzt. Sie werden oft von Sadaharu begleitet, ihrem riesigen weißen Haustierhund, der so groß wie ein Pferd ist und die Angewohnheit hat, Menschen in den Kopf zu beißen.

Die Erzählung von Gintama ist hauptsächlich episodisch und konzentriert sich auf das Trio, das eine Vielzahl seltsamer, gefährlicher oder einfach nur lächerlicher Aufträge von den Bürgern Edos annimmt, um ihre Miete zu bezahlen. Ihre Klienten reichen von außerirdischen Adligen bis hin zu lokalen Gangstern, und ihre Jobs führen oft zu chaotischen Begegnungen mit anderen wichtigen Figuren in der Stadt. Dazu gehört die Shinsengumi, eine Gruppe von Samurai, die jetzt als Spezialpolizei für die Marionettenregierung dienen. Trotz ihrer offiziellen Pflichten sind die Shinsengumi-Mitglieder selbst eine Ansammlung von Sonderlingen, darunter der stalkerähnliche Kommandant Isao Kondo, der mayonnaisebesessene Vize-Kommandant Toshiro Hijikata und das sadistische Wunderkind Sougo Okita. Andere wiederkehrende Charaktere sind Kotaro Katsura, ein ehemaliger Kriegskamerad Gintokis, der jetzt ein gesuchter Terroristenführer ist und versucht, die Aliens zu stürzen, und sein seltsames Haustier „Elizabeth“, eine anthropomorphe, entenähnliche Kreatur.

Während die Show für ihren unermüdlichen Humor, Meta-Humor und Parodien auf andere Anime und die Popkultur berühmt ist, enthält sie auch mehrere bemerkenswerte ernste Action-Arcs, die eine übergreifende Handlung vorantreiben. Einer der frühesten und wichtigsten davon ist der Benizakura-Arc, der Gintokis ehemaligen Freund und nunmehrigen Todfeind Shinsuke Takasugi einführt, einen skrupellosen Revolutionär, der eine Terroristengruppe namens Kiheitai anführt, mit dem Ziel, die korrupte Welt zu zerstören, die die Samurai nicht schützen konnten. Der Yoshiwara in Flames-Arc taucht in die Hintergrundgeschichte von Kaguras Bruder Kamui ein und stellt eine mächtige weibliche Ninja namens Tsukuyo vor, die eine bedeutende Verbündete wird. Später konzentriert sich der Four Devas of Kabukicho-Arc auf einen Bandenkrieg im Vergnügungsviertel, der Gintokis Freunde und Nachbarn bedroht, und erkundet Themen wie Familie und Zugehörigkeit.

Im Verlauf der Serie werden diese dramatischen Handlungsstränge häufiger und miteinander verknüpft. Der Shogun Assassination-Arc markiert einen wichtigen Wendepunkt, stürzt das Land in politisches Chaos und enthüllt die Wahrheit über Gintokis Vergangenheit und seine Beziehung zu seinem ehemaligen Lehrer Yoshida Shouyou. Dies führt direkt zum Farewell, Shinsengumi-Arc, der die Auflösung der Shinsengumi und das Schicksal ihrer Mitglieder behandelt. Die letzte Saga des Anime adaptiert den Silver Soul-Arc, ein umfangreicher, mehrteiliger Abschluss, in dem die Yorozuya und all ihre früheren Verbündeten und Feinde sich vereinen müssen, um sich einer unsterblichen, weltzerstörenden Entität namens Utsuro zu stellen, der der dunkle Ursprung ihres geliebten Meisters ist. Die Serie endet nach einer langen und brutalen finalen Schlacht, die über das Schicksal des Landes der Samurai entscheidet.