In einer futuristischen Welt, in der Roboter alltäglich sind, erschafft ein brillanter, aber von Trauer gezeichneter Wissenschaftler namens Dr. Tenma einen mächtigen Roboterjungen, um seinen eigenen Sohn Tobio zu ersetzen, der bei einem Verkehrsunfall ums Leben kam. Der Roboter ist mit immenser Stärke, raketenbetriebenen Gliedmaßen und fortschrittlicher künstlicher Intelligenz ausgestattet und soll wie ein echter menschlicher Junge aussehen und handeln. Dr. Tenma ist jedoch schließlich enttäuscht, als seine Schöpfung nicht wachsen oder die Emotionen eines verlorenen Sohnes wirklich nachahmen kann, und verlässt den Roboter.

Der Roboterjunge gerät in die Fänge eines grausamen Zirkusbesitzers namens Hamegg, der ihn zwingt, als Bühnenarbeiter und Ausstellungsstück aufzutreten und ihn schlecht behandelt. Sein Schicksal wendet sich, als er von Professor Ochanomizu entdeckt wird, dem gutherzigen und weisen Leiter des Wissenschaftsministeriums. Der Professor rettet den Roboter, wird sein gesetzlicher Vormund und gibt ihm den Namen Astro Boy, um ihm zu helfen, sich als Sechstklässler in die menschliche Gesellschaft zu integrieren. Professor Ochanomizu erkennt, dass Astro Boy nicht nur unglaubliche Kräfte besitzt, sondern auch eine einzigartige Fähigkeit für menschliche Emotionen, bekannt als Kokoro.

Während sich Astro Boy an sein neues Leben gewöhnt, nutzt er seine Superkräfte, um Metro City vor verschiedenen Bedrohungen zu schützen. Dazu gehören abtrünnige Roboter, außerirdische Invasoren und menschliche Verbrecher, die Roboter hassen. Ein wiederkehrendes Thema ist die soziale Vorurteile und Diskriminierung, der Roboter von Menschen ausgesetzt sind, die sie als bloße Werkzeuge betrachten. Obwohl er ein mächtiger Superheld ist, ist Astro Boy im Herzen ein Pazifist, der versucht, Probleme möglichst durch Verständnis und Mitgefühl statt durch Gewalt zu lösen. Er wird oft von seiner lebhaften jüngeren Schwester Uran, einem weiteren von Professor Ochanomizu geschaffenen Roboter, und seinen menschlichen Schulfreunden Kenichi, Shibugaki und Tamao begleitet.

Die Geschichte erforscht Astro Boys Suche nach seiner eigenen Identität, während er mit dem Wissen kämpft, dass er geschaffen wurde, um ein totes Kind zu ersetzen. Sein ursprünglicher Schöpfer, Dr. Tenma, taucht oft als komplexer Antagonist wieder auf, der manchmal versucht, seine Schöpfung zurückzugewinnen oder zu beweisen, dass Roboter Menschen überlegen sind. Astro Boy steht auch mächtigen Roboterrivalen wie Atlas gegenüber, einer ähnlichen Schöpfung mit dunklerem Zweck, und muss sich großen Konflikten stellen, wie einer Roboterrevolte unter der Führung des Blauen Ritters und Anti-Roboter-Bewegungen, die von Menschen wie dem Politiker Acetylenlampe vorangetrieben werden. In diesen Abenteuern stellt die Serie konsequent tiefgreifende philosophische Fragen über die Beziehung zwischen Menschheit und Technologie, die Natur des Bewusstseins und was es wirklich bedeutet, ein Herz zu haben.